Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями. Методы окраски ретикулоцитов Как считать ретикулоциты

Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

Реактивы

Можно использовать один из следующих красителей:

Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% - 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Специальное оборудование

Ход определения

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Окраска ретикулоцитов на стекле

При окраске ретикулоцитов на стекле хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из перечисленных выше красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Стеклографом маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Перед проведением анализа готовят влажную камеру. Обычно для этого пользуются чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 – 10 мин. Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска ретикулоцитов в пробирке

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим.

Перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски бриллиантового крезилового синего. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 минут. Затем снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II.

Метод 3 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I.

В настоящее время в продаже имеются готовые красители для ретикулоцитов заводского изготовления. Окраска ретикулоцитов с их помощью производится согласно прилагаемой инструкции.

Подсчет ретикулоцитов.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Фотографии ретикулоцитов:

Находят поля зрения, где эритроциты располагаются раздельно. В этих полях зрения необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Большая точность получается при подсчете на 2000 – 3000 эритроцитов.

В связи с тем, что в поле зрения располагается большое количество эритроцитов, что затрудняет подсчет, необходимо ограничить (уменьшить) поле зрения. Для этого можно воспользоваться либо специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров, либо воспользоваться специальным «окошком» (из бумаги вырезают круг диаметром несколько меньше окуляра, в центре круга вырезают небольшой ромбик и вставляют полученное окошко в окуляр).

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 100 (в процентах) или на 1000 (в промилле) эритроцитов.

Пример: При подсчете в мазке 1000 эритроцитов выявлено, что 15 эритроцитов из 1000 имеют зернисто-сетчатую субстанцию той или иной степени, то есть являются ретикулоцитами. Следовательно, количество ретикулоцитов в данном случае составляет 1,5% или 15‰.

Литература:

Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под редакцией Меньшикова В. В. - Москва, «Медицина», 1987 г
Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы - «Клинические лабораторные исследования» - Москва, «Медицина», 1984 г.

Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии

Метод подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества.

Ретикулоциты

Ретикулоциты – молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в их цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции (ретикулума), представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии.

Патологические включения в эритроцитах

Тельца Жолли (тельца Хауэлла-Жолли) - мелкие круглые фиолетово-красные включения размероммкм, встречаются по 1 (реже по 2 - 3) в одном эритроците. Предсталяют собой остаток ядра после удаления его РЭС. Выявляются при интенсивном гемолизе и "прегрузке" РЭС, после спленэктомии, при мегалобластной анемии..

Цитохимическое исследование липидов

Цитохимическое исследование липидов основано на применении красящих веществ, растворяющихся в жирах (судан III, судан IV, черный судан и др.). Для выявления нейтрального жира пользуются суданом III, окрашивающим жир в оранжевый цвет. Липоиды выявляются лучше суданом черным (черное окрашивание).

Анализ мочи по Нечипоренко

Метод Нечипоренко в отечественной лабораторной диагностике является наиболее распространенным методом количественного определения форменных элементов в моче. Этот метод наиболее прост, доступен любой лаборатории и удобен в амбулаторной практике, а также имеет ряд преимуществ перед другими известными количественными методами исследования осадка мочи. По методу Нечипоренко определяют количество форменных элементов (эритроцитов, лейкоцитов и цилиндров) в 1 мл мочи.

Методы окраски ретикулоцитов

Принцип. Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-сетчатую субстанцию ретикулоцитов.

Реактивы. Можно использовать один из следующих красителей: 1) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном этиловом спирте. Для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса. На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски; 2) раствор азура 1 по П. Н. Корикову: азур I - 1 г; аммония оксалат - 0,4 г; натрия хлорид - 0,8 г; 96% этиловый спирт- 10мл; дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в термостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор хранят в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать; 3) раствор азура II: азур II - 1 г; натрия цитрат - 5 г; натрия хлорид - 0,4 г; дистиллированная вода - 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Ход определения. Окраска на стекле. Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки.

Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее топкий мазок и немедленно помещают во влажную камеру на 3–4 мин (можно пользоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты, марли или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

В приготовленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция - в синий цвет.

Окраска в пробирке. Методика 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на 1 каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски (реактив 1). В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20–30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Методика 3: в пробирку вносят 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5-6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1,5 ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1,5–3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Подсчет ретикулоцитов. В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-сетчатая субстанция - в синий или синеватофиолетовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов (большая точность получается при подсчете 2000–3000 эритроцитов) и отметить среди них количество клеток, содержащих зернисто-сетчатую субстанцию. На практике для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения.

При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 7×, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

Техника забора крови на ретикулоциты и техника подсчета количества ретикулоцитов.

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями

Принцип метода:Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

Можно использовать один из следующих красителей: Раствор азура I;Раствор азура II;

Ход определения: Окраску проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II

В пробирку помещают 0,05 мл раствора краски азур II и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20 – 30 минут. Снова перемешивают и готовят тонкие мазки.

Окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I

В пробирку помещают 0,3 – 0,5 мл раствора краски азур I и 5 – 6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1 – 1,5 часа (ретикулоциты окрашиваются лучше при экспозиции 1,5 – 3 часа). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Приготовленные мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. В мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

Ретикулоциты являются важным показателем регенераторной способности костного мозга. Увеличение их в периферической крови (ретикулоцитоз) отмечается при гемолитических анемиях, при гемолитических кризах, при острых кровопотерях, малярии, при лечении железом железодефицитных анемий, при остром недостатке кислорода. Наличие повышенного количества ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных брюшным тифом, язвенной болезнью).

Снижение количества или отсутствие ретикулоцитов (ретикулоцитопения) наблюдается при арегенераторных апластических и гипопластических анемиях; анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты; при метастазах рака в кость; лучевой болезни; лучевой терапии; лечении цитостатиками.

Техника проведения пробы Ривальта.

Про́ба Рива́льта - биохимический тест для дифференцировании транссудата и экссудата.

Методика заключается в следующем: Экссудаты содержат серомуцин (соединение глобулиновой природы), дающий положительную пробу (денатурацию) со слабым раствором уксусной кислоты. В цилиндр наливают 100-150 мл дистиллированной воды, подкисляют 2-3 каплями ледяной уксусной кислоты и добавляют по каплям исследуемую жидкость. Падающая капля экссудата образует помутнение в виде белого облачка, опускающегося до дна сосуда. Капля транссудата не образует помутнения, или оно бывает незначительным и быстро растворяется. Несмотря на указанные различия экссудатов и транссудатов, разграничить их на практике не всегда легко, так как иногда приходится иметь дело с рядом переходных жидкостей, а также экссудатами, которые по содержанию белка и относительной плотности стоят близко к транссудатам.

Методы подсчета количества ретикулоцитов

1. Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями.

Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте + раствор азура I + раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I).

2. Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии.

Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминисцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминисцентного микроскопа и специальных красителей, всвязи с чем доступен лишь немногим лабораториям.

Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминисцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесители в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски. Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

3. Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора.

В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H.Wallace и Joseph R. Culter в 1947 году. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов. Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются.

Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов – относительное (процентное) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемое с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод), стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex-XT-200i) дополнительные инфармативыне ретикулоцитарные параметры:

1. Ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией).

2. Ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией).

3. Ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией).

4. Незрелая фракция ретикулоцитов (IFR%, Immature Reticulocyte Fraction).

Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности косного мозга.

Методика (анализатор Sysmex-XT-2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюорсцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается болееэритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Ретикулоциты

Ретикулоинты - молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выявляется при специальном методе окраски - суправитальном, т. е. без предварительной фиксации клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полиморфизмом: чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикулоцитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, отдельных нитей и затем отдельных зерен. В мазках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цвета - полихроматофильны, т. е. окрашены разными красителями.

Определение количества ретикулоцитов производится при микроскопии специально окрашенных мазков.

Унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их бриллиантовым крезиловым синим, азуром I или азуром II непосредственно на стекле или в пробирке (1972).

Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто-нитчатую субстанцию ретикулоцитов.

1.Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96 % в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.

2.Раствор азура I, предложенный П. Н. Кориковым: азур 1 - 1 г, аммония оксалат - 0,4 г, натрия хлорид- 0.8 г, этиловый спирт 96 % 10 мл, дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2-3 дня в термостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.

3.Раствор азура II следующего состава: азур II 1 г, натрия цитрат 5 г, натрия хлорид, 0,4 г, дистиллированная вода 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течениемин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтрую). Хранят в посуде из темного стекла.

Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю крови на мазок краски, готовят из нее тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3-4 мин (можно пользоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

В приготовленных таким образом мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий цвет.

Метод 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1 % раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 0,04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют намин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3: в пробирку помещают 0,3-0,5 мл раствора краски 2 и 5-6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку накрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1-2 часа (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 2-3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в синий или синевато-фиолетовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. Практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения.

При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 10Х, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают.

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии.

Использование способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым.

1. Раствор акридинового оранжевого на изотоническом растворе хлорида натрия и концентрации 1:5000. Для приготовления изотонического раствора рекомендуют использовать дистиллированную воду pH 5,8-6,8, Раствор акридинового оранжевого должен быть свежим; хранят его не более 3-5 дней в темном флаконе с притертой пробкой.

2. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

Можно использовать афлуоль или обычное иммерсионное масло с флюоресценцией, погашенной нитробензолом (0,3 мл нитробензола на 1 мл масла). Ю. Н. Зубжицкий в качестве нефлюореспирующего масла предлагает использовать перегнанный анизол.

Специальное оборудование. Микроскоп ультрафиолетовый МУФ-ЗМ или люминесцентный.

Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 ч). Смесь перемешивают в течение 2 мин, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом.

Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17.

В препарате эритроциты не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-нитчатая субстанция светится ярко-красным цветом.

Замечено, что в крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается.

Метод отличается простотой и требует немного времени; благодаря яркому свечению ретикулоциты легко подсчитать.

Нормальные величины. У здоровых число ретикулоцитов составляетпромиле, или 0,2-1,2 %.

Число ретикулоцитов в крови отражает регенеративные свойства костного мозга, и оценка его широко используется при различных анемиях (см. табл. 24). Повышение количества ретпкулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях, особенно в период криза (количество ретикулоцитов может быть%), а также на фоне лечения анемии Аддисона Бирмера витамином В12 (ретикулоцитарный криз - подъем числа ретикулоцитов на 4-8-й день лечения). Снижение количества ретикулоцитов характерно для гипопластической анемии, рецидива анемии Аддисона-Бирмера

Определение количества ретикулоцитов может быть использовано для определения продукции эритропоэза и вычисления срока жизни эритроцитов.

Литература. Гомзякова Н. В. Лаб, дело, 1960, № 5, с. 38-39;

Зубжицкий Ю. Н. Лаб. дело; 1967, № 2, с. 35;

Ретикулоциты (reticulocytus)

Морфология и функции ретикулоцитов. Методы подсчета ретикулоцитов. Количественное содержание ретикулоцитов.

Морфология и функции ретикулоцитов

Ретикулоциты - это молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер.

Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие зернисто-сетчатой субстанции, которая проявляется при суправитальной окраске, т. е. без предварительной фиксации клеток.

Электронно-микроскопически показано, что зернисто-сетчатые структуры представляют собой остатки эндоплазматической сети, рибосом и митохондрий, содержащие РНК. В ретикулоцитах в незначительной степени осуществляется синтез белка (глобина), гема, пуринов, пиримидиннуклеотидов, фосфатидов, липидов, однако РНК в них не синтезируется. В течение 2 дней ретикулоцит остается в кровеносном русле, после чего по мере уменьшения РНК становится зрелым эритроцитом.

В мазках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цвета - полихроматофильны, т.е. окрашены разными красителями.

Методы подсчета ретикулоцитов

В настоящее время используется унифицированный метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их

бриллиантовым крезиловым синим,
азуром I или
азуром II непосредственно на стекле или в пробирке.

1. Принцип метода

Выявление зернисто-сетчатой субстанции эритроцитов при окраске щелочными красками с дальнейшим подсчетом их в мазке крови.

2. Реактивы:

а) насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96% в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса): 1,2 г краски на 100 мл спирта;

б) раствор азура I: азур I - 1 г, аммония оксалат - 0,4 г, натрия хлорид - 0,8 г, этиловый спирт 96% - 10 мл, дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2–3 дня в тер- мостат при 37 °С и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать;

в) раствор азура II: азур II - 1 г, натрия цитрат - 5 г, натрия хлорид - 0,4 г, дистиллированная вода - 45 мл. Раствор оставляют в термостате при 37 °С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15–20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

3. Окраска

хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте;
на приготовленные подобным образом стекла наносят каплю крови, делают тонкий мазок и сейчас же помещают стекло во влажную камеру. Для этого используют чашку Петри с крышкой, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты;
во влажной камере мазки выдерживают 3–5 мин, а затем высушивают на воздухе. Зернисто-сетчатая субстанция ретикулоцитов окрашивается в фиолетово-синий цвет, четко выделяясь на зеленовато-голубоватом фоне эритроцитов.

метод 1: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1% раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краску добавляют 40 мкл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 и 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 20– 30 мин. Перемешивают и готовят тонкие мазки;
метод 3: в пробирку помещают 0,3–0,5 мл раствора краски 2 и 5–6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1–1½ ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1½ ч –3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

4. Подсчет ретикулоцитов

В мазках эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий или синевато-фиолетовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом;
необходимо подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернисто-нитчатую субстанцию. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, в котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения;
практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр ×7, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 1000 или на 100 эритроцитов.

Количественное содержание ретикулоцитов

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается при:

кровопотерях (особенно острой);
гемолитических анемиях, особенно в период криза (до 20–30 %);
на фоне лечения мегалобластной анемии витамином В12 (ретику- лоцитарный криз - подъем числа ретикулоцитов на 4–8-й день лечения).

Понижение количества ретикулоцитов характерно для:

апластических и гипопластических анемий;
нелеченной мегалобластной анемии;
лучевой болезни;
приема цитостатических препаратов.

Суправитальный метод окраски ретикулоцитов.

Выявление зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при окраске бриллиант-крезиловым синим без предварительной фиксации.

1 % раствор бриллиант-крезилового синего: 50 мг краски растворяют в 5 мл физиологического раствора и добавляют 20 мг цитрата натрия (раствор хранят в посуде из темного стекла, годен в течение нескольких дней).

На предметное стекло с лункой наносят 2 капли 1 % раствора краски бриллиантового крезилового синего и 1 каплю крови. Осторожно перемешивают стеклянной палочкой и смесь помещают во влажную камеру (чашку Петри, в которую по краям вкладывают слегка смоченные валики марли или ваты) на 30 минут при комнатной температуре. Затем делают мазки и высушивают.

В мазках эритроциты окрашиваются в желтовато-зеленый цвет, а зернисто-сетчатая субстанция в ретикулоцитах - в синий и фиолетовый цвет.

Мазки микроскопируют с иммерсионным объективом. Подсчет ретикулоцитов производят на 1000 эритроцитов (большая точность получается при подсчете эритроцитов).

Увеличение числа ретикулоцитов наблюдается при:

стимуляции эритропоэза (кровопотеря, гемолиз, ретикулоцитарный криз при успешном лечении В 12 -дефицитной анемии, острый недостаток кислорода).

Уменьшение числа ретикулоцитов наблюдается при:

угнетении эритропоэза (апластические и гипопластические анемии, нелеченные В 12 -дефицитные анемии, метастазы рака в кости),

заболеваниях почек, эндокринных заболеваниях.

МЕТОДЫ ПОДСЧЕТА КОЛИЧЕСТВА РЕТИКУЛОЦИТОВ

(1) Подсчет количества ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями. Данный метод является на практике наиболее используемым методом в связи с тем, что он простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, соответственно может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории. Принцип метода основан на выявлении зернисто-сетчатой субстанции ретикулоцитов при суправитальной окраске щелочными красками (насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте / раствор азура I /раствор азура II) с дальнейшим подсчетом их в мазке крови. Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке. Подсчет осуществляют с помощью микроскопа: приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопируют с иммерсионным объективом; в мазке ретикулоциты и эритроциты окрашены в желтовато-зеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция в ретикулоцитах – в синий (при окраске азуром II и бриллиантовым крезиловым синим) или синевато-фиолетовый цвет (при окраске азуром I). (2) Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии. Данный метод отличается простотой и требует немного времени, более точен по сравнению с обычным методом, так как при люминесцентной микроскопии обнаруживаются мельчайшие зерна сетчато-нитчатого вещества, однако он возможен только при наличии люминесцентного микроскопа и специальных красителей, в связи с чем доступен лишь немногим лабораториям. Принцип подсчета количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии основан на использовании способности субстанции ретикулоцитов флюоресцировать после обработки крови акридиновым оранжевым. Кровь смешивают с акридиновым оранжевым в пробирке или смесителе в соотношении 1 часть крови и 10 частей краски (смесь можно хранить не более 5 часов). Смесь перемешивают в течение 2 минут, каплю смеси наносят на предметное стекло и накрывают покровным стеклом. При этом жидкость не должна выходить за пределы покровного стекла. Микроскопируют с помощью светофильтра ЖС-17. В препарате эритроциты имеют темно-зеленые очертания и не флюоресцируют, а в ретикулоцитах зернисто-сетчатая субстанция светится ярко-красным цветом, благодаря чему ретикулоциты легко подсчитать. В крови, стабилизированной гепарином или цитратом натрия, флюоресценции ретикулоцитов не наблюдается. (3) Автоматический подсчет количества ретикулоцитов с помощью гематологического анализатора. В современных гематологических анализаторах технология подсчета форменных элементов крови основана на кондуктометрическом методе, предложенном H. Wallace и Joseph R. Culter в 1947 г. Принцип метода заключается в подсчете числа и определении характера импульсов, возникающих при прохождении клетки через отверстие малого диаметра (апертуру), по обе стороны которого расположены два изолированных друг от друга электрода. Каждое прохождение клетки через апертуру сопровождается появлением электрического импульса, который регистрируется электронным датчиком. Разделение клеток по категориям (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, осадок) осуществляется прибором на основании анализа амплитуды полученных импульсов.Чтобы определить концентрацию клеток, достаточно пропустить определенный объем пробы через канал и подсчитать количество импульсов, которые при этом генерируются. Следует обратить внимание на то, что помимо классического параметра ретикулоцитов - относительное (%) содержание ретикулоцитов (RET%, percent of reticulocytes), определяемого с помощью 1 и 2 методов лабораторной диагностики, в связи с появлением высокотехнологичных гематологических анализаторов (3 метод) стало возможным получать (например, с помощью запатентованного флюоресцентного красителя для анализатора Sysmex -XT- 2000i) дополнительные информативные ретикулоцитарные параметры: ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией); ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией); ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией); незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction). Дифференцировка ретикулоцитов, основанная на степени зрелости и, соответственно, содержании нуклеиновых кислот, является отражением гемопоэтической активности костного мозга. Методика (анализатор Sysmex -XT- 2000i). В проточной кювете клетки пересекают луч полупроводникового лазера, при этом происходит рассеивание луча под большим и малым углами и возбуждение флюоресцентного красителя. Это позволяет определять различные стадии зрелости ретикулоцитов по содержанию РНК в клетках и интенсивности их свечения. Автоматизированный подсчет ретикулоцитов отличается высокой точностью (подсчитывается болееэритроцитов) и воспроизводимостью (коэффициент вариации составляет около 6%). Данная технология обеспечивает точный подсчет ретикулоцитов даже при их предельно низких концентрациях.

Ретикулоцитопении и ретикулоцитозы, причины развития, диагностическое значение их выявления.

Метод подсчета количества ретикулоцитов после окраски их бриллиантовым крез иловым синим, азуром I или азуром II непосредственно на стекле или в пробирке

Принцип. Суправитальная окраска красителями, выявляющими зернисто- нитчатую субстанцию ретикулоцитов.

Реактивы. Можно использовать один из следующих красителей.

1. Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синег о в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать этанол 96% в нескольких сменах прокаленного поришкл медного купороса).

2. Раствор азура I, предложенный П. Н. Кориковым: азур I - 1 г, аммония оксалат - 0,4 г, натрия хлорид - 0,8 г, этиловый спирт 96% -10 мл, дистиллированная вода - 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2-3 дня в термостат при 37°С и периодически энер| ично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.

3. Раствор азура II следующего состава: азур II - 1 г, натрия цитрат - 5 г натрия хлорид - 0,4 г, дистиллированная вода - 45 мл. Раствор оставляют в термос тате при 37°С на 2 сут, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течениемин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Специальное оборудование. Микроскоп.

Ход определения. О 1\ра^1\й пи с.ек/.е. Хорошо вымытое и обезжиренное предметное стекло подогревают над пламенем горелки. Стеклянной палочкой наносят на стекло каплю одного из красителей и готовят мазок из краски шлифованным стеклом. Маркируют сторону стекла, на которую нанесен мазок краски, стеклографом. В таком виде стекла можно заготовить впрок и хранить в сухом темном месте. Наносят каплю Крови на Ьшоог. I идО вьт из пее

тонкий мазок и тотчас помещают во влажную камеру на 3 4 мин (можно поль зоваться чашкой Петри с уложенными по краям валиками смоченной ваты или фильтровальной бумаги). Затем высушивают мазки на воздухе.

Окраска в пробирке. Метод /: перед употреблением готовят в пробирке рабочий раствор бриллиантового крезилового синего из расчета на каплю 1 % раствора оксалата калия 4 капли раствора краски 1. В краск) добавляют 0.04 мл крови (две пипетки до метки 0,02). Смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 30 мин Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 2: в пробирку помещают 0,05 мл раствора краски 3 у 0,2 мл крови. Смесь тщательно перемешивают и оставляют намин. Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Метод 3: в пробирку помещают 0,3-0,5 мл раствора краски 2 и 5-6 капель крови пипеткой от аппарата Панченкова. Пробирку закрывают резиновой пробкой, смесь тщательно, но осторожно перемешивают и оставляют на 1,5 ч (лучше окрашиваются ретикулоциты при экспозиции 1/2-3 ч). Перемешивают и готовят тонкие мазки.

Подсчет ретикулоцитов. В мазках эритроциты окрашены в желтоватозеленоватый цвет, зернисто-нитчатая субстанция - в синий или синева го-фио- летовый цвет.

Приготовленные одним из указанных выше способов мазки микроскопиру- ют с иммср1>шл1ным объективом. Нсобхидими подсчитать не менее 1000 эритроцитов и отметить среди них количество эритроцитов, содержащих зернистонитчатую субстанцию. Практически для большей точности пользуются специальным окуляром, в котором можно уменьшить поле зрения до требуемых размеров. При равномерных тонких мазках, в которых эритроциты расположены в один ряд, подбирают такое поле зрения, е котором имеется, например, 50 эритроцитов, и затем просчитывают 20 таких полей зрения. При отсутствии готового окуляра его можно легко приготовить, для чего отвинчивают окуляр 7х, вкладывают в него кусок бумаги с вырезанным небольшим квадратиком и завинчивают. Количество подсчитанных ретикулоцитор выражают на* 1000 или на 100 эритроцит ов.

Ретикулоциты

Ретикулоциты- молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выявляется при специальном методе окраски - суправитальном (прижизненная), т. е. без предварительной фиксации клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полиморфизмом; чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикулоцитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, отдельных нитей и затем отдельных зерен. В мазках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цвета - полихроматофильны, т. е. окрашены разными красителями.

Определение количества ретикулоцитов производится при микроскопии специально окрашенных мазков

3.2.1 Методика окраски мазков крови на ретикулоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

Принцип: Метод основан на подсчете числа ретикулоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов. Готовят одновременно 2 мазка (на тромбоциты и ретикулоциты).

Реактив:рабочий раствор краски по Алексееву

Ход определения: В капилляр для определения СОЭ набирают рабочий раствор до метки 0,75 мкл, и полный капилляр крови из прокола пальца больного. Соотношение красителя к крови составляет 1:4. Смесь оставляют на 2 часа, затем делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.

Подсчет производят следующим образом: сетки ретикулоцитов окрашиваются в синий цвет. Во время подсчета эритроцитов в поле зрения считают количество ретикулоцитов. Подсчитывают 1000 эритроцитов. Результат выражают в процентах.

Нормативная величина:В крови здорового человека содержится 0,2-1,0 %

(или 2-10 даже допускается до 12 проммиль) ретикулоцитов

Клинико-диагностическое значение:Появление ретикулоцитов в периферической крови указывает на усиленную работу костного мозга и используется при оценке различных видов анемий.

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях

Резкий ретикулоцитоз - отмечается при гемолитической желтухе

Снижение количества ретикулоцитов при наличии анемии говорит об апластическом типе кроветворения.

По уровню ретикулоцитов в крови анемии подразделяются на:

Регенераторные(количество ретикулоцитов 0,5-5 %- это постгеморрагические анемии);

Гиперрегенераторные(количество ретикулоцитов более 5% - это гемолитические анемии);

Гипо - и арегенераторные(количество ретикулоцитов снижено или они отсутствуют, несмотря на тяжелое течение анемии- гипо - и апластические, железо- и. В 12- дефицитные анемии).

Отзывы размещенные на данном сайте являются личным мнением лиц их написавших. Не занимайтесь самолечением!

Ретикулоциты (клиническое значение и лабораторная диагностика)

(1) ретикулоциты, имеющие ядро (эритронормобласты), причем зернистость у них располагается в виде плотного венчика вокруг ядра;

(2) ретикулоциты, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде клубка или глыбки;

(3) ретикулоциты, имеющие зернистость в виде густой сети;

(4) ретикулоцитов, имеющие зернисто-сетчатую субстанцию в виде отдельных нитей;

(5) ретикулоциты, содержащие отдельные зернышки.

При гемолитических анемиях (число ретикулоцитов может доходить до 60% и более (особенно сильно увеличиваясь при гемолитических кризах);

При острых кровопотерях (на 3 – 5 сутки после кровопотери возникает ретикулоцитарный криз), в том числе, увеличение ретикулоцитов позволяет заподозрить скрытое кровотечение (например, у больных язвенной болезнью желудочно-кишечного тракта, брюшным тифом);

При лечении железом железодефицитных анемий (через несколько дней (3 - 10) после начала антианемического лечения пернициозной анемии);

При остром недостатке кислорода;

При метастазах опухолей в костный мозг.

Аномальной формы гемоглобина;

При арегенераторных апластических и гипопластических анемиях;

При анемиях, вызванных недостаточностью содержания железа, витамина B12, фолиевой кислоты (микроцитарно-гипохромные и мегалобластные анемии);

При сидеробластной анемии;

При метастазах рака в кость;

При лучевой болезни и лучевой терапии;

При лечении цитостатиками;

При аутоиммунных заболеваниях системы кроветворения;

При заболеваниях почек;

При рецидиве анемии Аддисона-Бирмера;

Неправильный выбор антикоагулянта или недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом;

Длительное сдавливание руки жгутом;

Прием сульфаниламидов (возможны как заниженные, так и завышенные результаты);

Переливание крови незадолго до исследования;

Гемолиз пробы крови.

Оценка активности эритропоэза при состояниях, сопровождающихся гемолизом или кровопотерей;

Ценка способности костного мозга к регенерации после цитотоксической терапии и трансплантации костного мозга;

Ценка восстановления синтеза эритропоэтина после трансплантации почки;

Допинговый контроль у спортсменов (прием эритропоэтина);

Диагностика неэффективного гемопоэза или снижения продукции эритроцитов;

Дифференциальная диагностика анемий;

Детекция нарушения регенераторной способности костного мозга при дефиците железа, витаминов B12, B6, фолатов, меди и мониторинга соответствующей терапии;

Оценка реакции на терапию эритропоэтином, эритросупрессорами.

Ретикулоциты с низким содержанием РНК, наиболее зрелые (LFR%, low fluorescence reticulocyte fractions, фракция ретикулоцитов с низкой флуоресценцией);

Ретикулоциты со средним содержанием РНК (MFR%, medium fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов со средней флуоресценцией);

Ретикулоциты с высоким содержанием РНК (HFR%, high fluorescence reticulocyte fractions) - фракция ретикулоцитов с высокой флуоресценцией);

Незрелая фракция ретикулоцитов (IRF%, Immature Reticulocyte Fraction).

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями

Подсчет ретикулоцитов в мазке после окраски их специальными красителями является на практике наиболее используемым методом подсчета количества ретикулоцитов. Это связано с тем, что метод простой, достаточно дешевый и не требует специального дорогостоящего оборудования, в связи с чем может применяться в любой клинико-диагностической лаборатории.

Принцип метода

Реактивы

Можно использовать один из следующих красителей:

Насыщенный раствор бриллиантового крезилового синего в абсолютном спирте (для приготовления абсолютного спирта надо выдержать 96% этанол в нескольких сменах прокаленного порошка медного купороса). На 100 мл абсолютного спирта берут 1,2 г краски.
Раствор азура I: азур I – 1 г, аммония оксалат – 0,4 г, натрия хлорид – 0,8 г, этиловый спирт 96% - 10 мл, дистиллированная вода – 90 мл. Раствор краски в закрытом флаконе помещают на 2 – 3 дня в термостат при 37° C и периодически энергично взбалтывают. Затем охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор сохраняют в посуде из темного стекла. При появлении осадка краску следует снова профильтровать.
Раствор азура II: азур II – 1 г, натрия цитрат – 5 г, натрия хлорид – 0,4 г, дистиллированная вода – 45 мл. Раствор оставляют в термостат при 37° C на 2 суток, периодически помешивая. Для ускорения растворения краску можно прогреть на слабом огне в течение 15 – 20 мин, не доводя до кипения. Охлаждают до комнатной температуры и фильтруют. Хранят в посуде из темного стекла.

Специальное оборудование

Ход определения

Окраску ретикулоцитов проводят либо на стекле, либо в пробирке.

Окраска ретикулоцитов на стекле

Окраска ретикулоцитов в пробирке

Окраска ретикулоцитов в пробирке отличается при использовании разных красителей.

Метод 1 – окраска ретикулоцитов в пробирке бриллиантовым крезиловым синим.

Метод 2 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром II.

Метод 3 - окраска ретикулоцитов в пробирке азуром I.

Подсчет ретикулоцитов.

Фотографии ретикулоцитов:

Количество подсчитанных ретикулоцитов выражают на 100 (в процентах) или на 1000 (в промилле) эритроцитов.

Литература:

Справочник «Лабораторные методы исследования в клинике» под редакцией Меньшикова В. В. - Москва, «Медицина», 1987 г
Любина А. Я., Ильичева Л. П. и соавторы - «Клинические лабораторные исследования» - Москва, «Медицина», 1984 г.

Подсчет количества ретикулоцитов при помощи люминесцентной микроскопии

Ретикулоциты

Патологические включения в эритроцитах

Цитохимическое исследование липидов

Анализ мочи по Нечипоренко

Ретикулоцит - это что такое в анализе крови? Показатели нормы и обозначение

Ретикулоцит - это предшественник эритроцита, то есть это эритроцит в молодой форме. В крови здорового человека их содержание составляет 0,2-1,2 %. Данное соотношение отражает содержание ретикулоцитов в крови относительно эритроцитов. Созревают они 4-5 дней.

Основные понятия

Характерная особенность молодых форм эритроцитов – в цитоплазме присутствует зернисто-нитчатая субстанция, представляющая собой агрегированные рибосомы и митохондрии. Выявить данную субстанцию можно, используя особый метод окрашивания мазков крови. Такую окраску ретикулоцитов называют суправитальной, то есть она производится без предварительной фиксации клеток.

Группы ретикулоцитов

Всего специалисты выделяют пять основных групп ретикулоцитов. Отличаются они по ретикулярной сеточке. Густота ее и возраст находятся в обратной пропорциональности: чем гуще сеточка, тем они моложе. Разберемся, что представляет собой самый молодой ретикулоцит.

Это клетка, которая имеет сеточку в виде густого клубка. Относятся данные клетки к первой группе. Ретикулоциты более зрелой формы проявляются в виде субстанции, которая имеет четко различимую сеточку. В четвертой и пятой группе она представлена отдельными нитями и зернами. Чаще всего в крови здоровых людей содержатся ретикулоциты именно последних групп, то есть более зрелые. Как правило, они составляют около 80 % от числа всех остальных. При усиленной регенерации, которая характерна для некоторых патологий, увеличивается количество ретикулоцитов первых трех групп. К таким патологиям можно отнести:

Ретикулоцитарный криз, сопровождающий В12-дефицитную анемию.

Функции, которые выполняют ретикулоциты

Ретикулоцит - это тоже эритроцит. Для него характерна такая же функция, как и для эритроцитов. То есть клетки также переносят молекулы кислорода к разным тканям и органам, однако эффективность данного процесса значительно ниже, чем при переносе кислорода зрелыми эритроцитами. Ретикулоциты могут адсорбировать молекулы железа, которое содержится в гемоглобине. Это возможно благодаря рецепторам, восприимчивым к трансферрину. Зачем осуществляют подсчет ретикулоцитов? Об этом далее.

Механизм забора крови

Забор образца крови на определение этого показателя производится в составе общего анализа. Если существует необходимость определения уровня ретикулоцитов, то врач, который назначил анализ, указывает в направлении необходимость дополнительного подсчета.

Данный анализ не нуждается в особой подготовке, однако традиционно его сдают натощак утром. В то же время, если существует необходимость, то его можно сдать в любое время суток. Кровь для анализа следует брать из пальца, ее исследование проводится в лаборатории, в гематологическом отделе.

Подсчёт количества ретикулоцитов осуществляется в суправитально окрашенном мазке. Используется микроскопический метод, то есть их количество просто подсчитывают, поместив образец крови под микроскоп. На сегодняшний день существует аппаратный метод подсчета. Используют его современные лаборатории.

Обозначение ретикулоцитов в анализе крови - RET.

Проведение анализа

Существует несколько методов проведения подобного исследования:

Стеклышко моют, сушат и нагревают при помощи специальной горелки. Далее на него наносят один из трех красителей, затем добавляют каплю крови, после чего делают тонкий мазок. Помещают стеклышко в чашку Петри или другую камеру на определенное время, затем осуществляют его просушивание на свежем воздухе.
Если пользуются пробиркой, то в ней размещают окрашивающее вещество, туда же добавляют каплю крови. Смесь необходимо перемешать. Выжидают время - от 20 минут до 3 часов, это зависит от того, какой реагент применяют. Затем снова перемешивают жидкость, которая находится в пробирке, из нее берут мазки.

Какой метод определяет более точные результаты, трудно сказать. Они оба хороши по-своему, но врач может посчитать нужным проведение анализа определенным способом, тогда он должен указать это в направлении.

Показатели

При подсчете уровня ретикулоцитов половые расхождения нормы имеют значение лишь после 12 лет. До этого возраста норма у детей обоих полов одинакова. В возрасте примернолет у девочек начинается менструация, которая носят регулярный характер. В результате ежемесячной потери крови расширяется диапазон колебаний эритроидных клеток.

1. У новорожденных норма находится в диапазоне от 0,15 до 1,5 %.

2. У детей в возрасте двух недель – от 0,45 до 2,0 %.

3. У детей в возрасте одного-двух месяцев – от 0,25 до 0,95 %.

4. У детей в возрасте полугода – от 0,2 до 1,0 %.

5. У детей в возрасте двух-шести лет – от 0,25 до 0,75 %.

6. У детей в возрасте шести-двенадцати лет – от 0,25 до 1,3 %.

7. У мужчин старше двенадцати лет – от 0,25 до 1,7 %.

8. У женщин старше двенадцати лет – от 0,12 до 2,1 %.

Что означает ситуация, когда ретикулоциты повышены?

Увеличение количества ретикулоцитов в крови

При анемиях различной этимологии определение числа ретикулоцитов играет особую роль. Если в крови повышено их содержание, то такая патология называется ретикулоцитозом. Если увеличение сопровождается повышением уровня гемоглобина, то это говорит о том, что костный мозг обладает хорошей регенераторной способностью. Это может происходить, если присутствуют следующие факторы:

Гемолитическая анемия разной этимологии. Представляет собой ряд заболеваний, которые характеризуются разрушением эритроцитов. Подобное явление называется гемолизом. В этом случае содержание в крови ретикулоцитов может достигать 60 %. Если возникает гемолитический криз, данная цифра может усугубиться.

Отравление гемотоксинами, вызывающими гемолиз. К гемотоксинам можно отнести яд гадюки и некоторые лекарственные препараты, которые используются для терапии эритремии. Малярийные токсины также способны вызывать гемолиз.

Терапия «Леводопой» при болезни Паркинсона.

Длительный прием некоторых противовоспалительных и жаропонижающих средств.

Терапия лекарственным препаратом «Эритропоэтин» анемических заболеваний.

Метастазы костного мозга.

Период восстановления после лучевой или химической терапии.

Ретикулоцитоз может быть ложным и истинным.

Для чего сдавать анализ на ретикулоциты? Этот вопрос часто задают.

Ложный и истинный ретикулоцитоз

Истинный ретикулоцитоз характеризуется повышением в крови числа молодых ретикулоцитов, которое сопровождается увеличением их количества в костном мозге.

Для ложного ретикулоцитоза характерно повышение числа ретикулоцитов исключительно в периферической крови, при этом в костном мозге их уровень остается в норме либо слегка понижен.

Сниженные показатели

Процесс снижения количества ретикулоцитов наблюдается при угнетении эритропоэза. Возникает в результате воздействия следующих факторов:

Длительный прием сульфаниламидов.

Прием некоторых препаратов, например «Хлорамфеникола» или «Карбамазепина».

Хронические инфекционные заболевания.

Некоторые тяжелые болезни почек, влияющие на эритропоэз.

Микседема или другая дисфункция щитовидной железы.

Опухоли в костном мозге.

Мы рассмотрели, что такое ретикулоцит. Это молодой эритроцит в крови человека.

Причины повышения ретикулоцитов, как определить функциональности кровеобразующей системы?

Иногда при назначении клинического обследования в общем анализе крови могут отдельно обозначаться RTC либо RЕT – аббревиатуры, которые показывают содержание ретикулоцитов. Они представляют собой безъядерные клетки, предшествующие эритроцитам (красным кровяным клеткам) в процессе их формирования. Ретикулоциты в анализе крови, их количество и соотношение с эритроцитами отражает состояние и репродуктивную функциональность костного мозга, а также всей кроветворной системы.

Медицинская справка

Детально определить, что такое ретикулоциты, можно таким образом: это клетки округлой либо звездчатой формы, которые образуются в костном мозге и трансформируются в эритроциты под воздействие гликопротеинового гормона эритропоэтина.

Окраска ретикулоцитов, как правило, розовая с синим оттенком. Их отличительной особенностью от более поздней формы становится наличие в структуре остаточных РНК, митохондрий и иных органелл, имеющих вид гранулярных и нитевидных формирований, утрата которых и свидетельствует о преобразовании в зрелую клетку.

Функциональные обязанности ретикулоцитов совпадают с эритроцитными – переносить кислород, но с гораздо меньшей эффективностью из-за низкого содержания в них гемоглобина. В основном они концентрируются в красном костном мозге, плоских и трубчатых костях, а в кровь поступают только созревшие красные клетки. Но допускается незначительная фракция незрелых ретикулоцитов и в периферийном кровотоке, что свидетельствует об активации процесса выработки эритроцитов (эритропоэза).

Процесс кровообразования

Эритропоэз начинается с преобразования эритробласта – клетки, содержащей ядро, но не имеющей гемоглобина, в пронормбласт. Далее в эритроидном ряду образуется базофильный эритробласт, который уже имеет задатки гемоглобинизации.

По мере накопления родоначальниками эритроцитов вещества, удерживающего кислород (гемоглобина), клетка проходит этапы полихроматофильного и далее оксифильного нормобласта. В этот период еще сохраняется ядро, инволюция которого приводит к формированию непосредственно молодого эритроцита – ретикулоцита, уже имеющего возможность удерживать и переносить кислород, углекислый газ.

Молодые красные клетки крови пребывают в месте своего образования до 40 часов, после чего небольшая их часть под воздействием эритропоэтина попадает в кровеносные сосуды, где свободно перемещается в течение 1,5 либо 2 суток. За это время клетка теряет ретикулум (остаточные нитевидные формирования) и превращается в эритроцит.

Стадии развития ретикулоцитов

В крови ретикулоциты по мере инволюции ретикулума проходят пять этапов созревания:

нулевая стадия – когда базофильное вещество (сетчатая внутриклеточная субстанция) имеет форму ядра, то есть скопление зернистости выглядит как своеобразный венчик;
первая стадия – базофильное вещество (БВ) приобретает сетчатую структуру в виде клубка;
вторая стадия – зернистая сеть равномерно распределена по клетке;
третья стадия – БВ выглядит как отдельные нити;
четвертая стадия – по периферии клетки БВ распределено в виде мелких зерен.

В здоровом организме ретикулоциты в кровотоке должны встречаться только III и IV стадий созревания (80 процентов), а 0 - II – в единичных экземплярах. Но чрезмерная гибель эритроцитов либо кислородное голодание стимулируют усиленную выработку почками эритропоэтина, что приводит к выбросу в сосуды незрелых клеток всех стадий и даже нормобластов.

Анализ крови на ретикулоциты

Подсчет ретикулоцитов в мазке крови не обязателен при гематологическом исследовании, но относится к общему клиническому анализу. Только при возникновении определенных подозрений у врача делается специальное обозначение в анализе.

Причины исследования

Причины обследования на количество RTC в крови заключаются в необходимости проверить работу костного мозга и почек по производству кровяных клеток и эритропоэтина в таких случаях:

при подозрении на анемии различного происхождения;
при необходимости контроля медикаментозной терапии дефицита железа, витамина В12 и фолиевой кислоты;
для наблюдения при приеме эритропоэтиносодержащих препаратов, эритросупрессоров;
при сильных внешних кровотечениях либо подозрении на внутренние;
в связи с необходимостью приема препаратов, нейтрализующих токсины в результате укусов ядовитых насекомых или змей;
для контроля выработки эритроцитов при пересадке костного мозга либо почки;
для определения онкологических заболеваний.

Последний пункт связан с особенностями метастазирования некоторых раковых опухолей в кровеобразующие органы.

Способ выявления

При потере ядра к кровяным клеткам применимы методы окраски только кислыми красителями. Посредством подкрашивания в мазке крови обозначаются элементы эритроидного ряда, которые затем обнаруживаются при помощи световой микроскопии. Для выделения ретикулоцитов из общей массы эритроцитов нужно использовать специальные препараты, меняющие цвет зернистой структуры клеток.

Непосредственно процесс выявления заключается в смешивании кровяной плазмы с бриллиантовым крезиловым синим или акридиновым оранжевым красителем инвитро (в пробирке) либо на стекле в пропорциях: 1 часть крови к 10 частям вещества.

Методы на стекле и инвитро принципиально различаются. В первом случае смешанные мазки крови с красителем на 10 минут опускают во влажную среду, после чего сушат и подсчитываю клетки под микроскопом. Во втором варианте перемешанный в пробирке состав оставляют на срок до 3 часов, затем повторно смешивают, делают мазок и подсчитывают.

Когда звёздчатые клетки ретикулоцитов становятся различимы, и определима степень их зрелости (по структуре подкрашенного БВ) можно получить информацию о состоянии костного мозга.

Допустимые показатели

Нормальный уровень ретикулоцитов соответствует процессу кровообразования в здоровом организме. Для упорядочивания данных используется специальная таблица, в которой нормальные диапазоны градируют по возрасту и половой принадлежности человека.

Норма ретикулоцитов в крови у детей

Ретикулоциты норма у детей варьирует в зависимости от конкретного периода формирования кровеобразующей системы. Так, у новорожденных до 14 дней допустимый показатель составляет от 0,15 до 1,5 процента по отношению к эритроцитам. Нормальные значения для грудничков до двух месяцев – от 0,45 до 2,1 процента, а до полугода – 0,25 – 0,9 процента. У ребенка с шести месяцев до года здоровыми считаются значения от 0,2 до 1 процента, и они стабилизируются вплоть до шестилетнего возраста. Далее диапазон сужается: с 7 до 12 лет он составляет от 0,2 до 1,3 процента.

Ретикулоциты в крови у взрослых

Дальнейшее допустимое содержание ретикулоцитов в крови зависит больше от пола ребенка, чем от возраста, и соответствует взрослым показателям. Это связано с началом менструального цикла у девочек, что подразумевает ежемесячную кровопотерю и, соответственно, увеличение в этот период производства кровяных клеток. Нормативные показатели:

допустимым уровнем молодых эритроцитов в крови у женщин и молодых девушек с 13 лет будет от 0,12 до 2,05 процента (от 1,2 до 20 промилле, соответственно);
количество ретикулоцитов у мужчин в норме составляет от 0,24 до 1,7 процента в общей эритроидной массе.

Так, у взрослого человека устанавливается постоянный диапазон допустимой концентрации молодых кровяных клеток, которые содержат зернисто-сетчатую субстанцию. При этом повышенные рекулоциты либо ретикулоцитарный криз свидетельствуют об определенных нарушениях в функционировании кроветворной системы.

Повышение ретикулоцитов

Повышенные ретикулоциты (или иначе ретикулоцитоз) могут иметь как позитивное, так и негативное значение для обследуемого. Увеличенное количество незрелых кровяных клеток бывает в случаях:

При положительных результатах терапии железосодержащими препаратами, витамином В12 и фолиевой кислотой, которые обычно наступают через неделю.
При восполнении объема крови после значительной кровопотери.
При положительных результатах лечения онкологических заболеваниях посредством противоопухолевых препаратов либо лучевой терапией.

Важно! Ретикулоцитоз наблюдается при кислородном дефиците на значительной высоте над уровнем моря.

К отрицательным значениям ретикулоцитоза относятся:

Последствия таких болезней, как брюшной тиф, которые провоцируют внутренние кровотечения.
Ретикулоциты повышены при интоксикации химическими ядами либо инородными агентами.
Ложный ретикулоцитоз показывает наличие незрелых клеток в крови при отсутствии их в костном мозге, что свидетельствует о воспалительных процессах либо метастазах в органе.
Ретикулоцитоз наблюдается при малярии, гемолитической анемии либо талассемии.

Повышенное содержание незрелых кровяных клеток в крови (ретикулоцитоз) чревато ее загустением, что может впоследствии привести к тромбозу, инфаркту либо инсульту.

Ретикулоциты в крови при беременности

У беременных женщин увеличивается общий объем крови благодаря плазме, поэтому наблюдается ее разжижение и снижение уровня эритроцитов. Из-за того, что в крови содержится недостаточно гемоглобина, развивается анемия, что активизирует процесс эритропоэза. Поэтому у беременных определяется высокий процент содержания ретикулоцитов. Клиника этого явления отвечает норме при физиологической адаптации организма к вынашиванию ребенка.

Ретикулоциты понижены

Ретикулоцитопения (когда уровень ретикулоцитов снижен) зачастую свидетельствует о поражениях почек и/или костного мозга. Факторами, понижающими содержание молодых эритроцитов, становятся:

Анемии, вызванные недостатком фолиевой кислоты, витамина В12 либо железа, которые приводят к разрушению эритроцитов.
Почечные заболевания, но понизить уровень ретикулоцитов они могут незначительно.
Злоупотребление алкоголем, что покажет снижение RTC из-за угнетения почечных функций, подавления работы костного мозга и непосредственного разрушения клеток в результате интоксикации.

Важно! Злокачественные опухоли тоже могут понижать уровень ретикулоцитов в крови. Это зависит от площади костного мозга, в которую метастазировал рак.

Сам по себе показатель содержания ретикулоцитов в крови не является диагнозом. При значительном отклонении от допустимого диапазона он задает общее направление диагностике.

Ретикулоциты - молодые эритроциты, образующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выявляется при специальном методе окраски - суправитальном (прижизненная), т. е. без предварительной фиксации клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полиморфизмом; чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикулоцитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, отдельных нитей и затем отдельных зерен. В мазках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цвета - полихроматофильны, т. е. окрашены разными красителями.

Определение количества ретикулоцитов производится при микроскопии специально окрашенных мазков

3.2.1 Методика окраски мазков крови на ретикулоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

Реактив: рабочий раствор краски по Алексееву

Оборудование: микроскоп

Подсчет производят следующим образом: сетки ретикулоцитов окрашиваются в синий цвет. Во время подсчета эритроцитов в поле зрения считают количество ретикулоцитов. Подсчитывают 1000 эритроцитов. Результат выражают в процентах.

Нормативная величина: В крови здорового человека содержится 0,2-1,0 %

(или 2-10 даже допускается до 12 проммиль) ретикулоцитов

Клинико-диагностическое значение: Появление ретикулоцитов в периферической крови указывает на усиленную работу костного мозга и используется при оценке различных видов анемий.

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях

Резкий ретикулоцитоз - отмечается при гемолитической желтухе

Снижение количества ретикулоцитов при наличии анемии говорит об апластическом типе кроветворения.

По уровню ретикулоцитов в крови анемии подразделяются на:

- регенераторные (количество ретикулоцитов 0,5-5 %- это постгеморрагические анемии);

- гиперрегенераторные (количество ретикулоцитов более 5% - это гемолитические анемии);

- гипо - и арегенераторные (количество ретикулоцитов снижено или они отсутствуют, несмотря на тяжелое течение анемии- гипо - и апластические, железо- и. В 12- дефицитные анемии).

Внимание! Ретикулоцитоз при отсутствии анемии указывает на скрытые, но хорошо компенсированные кровопотери.

> Подсчет ретикулоцитов

Данная информация не может использоваться при самолечении!
Обязательно необходима консультация со специалистом!

Для чего нужен подсчет ретикулоцитов?

Подсчет ретикулоцитов - это лабораторное исследование крови, которое позволяет оценить эффективность эритропоэза. Эритропоэзом называется процесс образования эритроцитов в костном мозге. А ретикулоциты - это клетки крови, которые являются переходной формой между предшественниками красных кровяных телец, образующимися в костном мозге, и эритроцитами, циркулирующими в кровяном русле. Их количество показывает, насколько интенсивно происходит процесс кроветворения.

В каких случаях производят подсчет эритроцитов?

Необходимость в подсчете ретикулоцитов возникает, когда в клиническом анализе крови обнаруживаются признаки анемии или нарушения эритропоэза: снижение или повышение количества эритроцитов или концентрации гемоглобина, появление эритроцитов ненормальных размеров или формы и пр. Исследование помогает диагностировать вид анемии и контролировать процесс ее лечения. Подсчет ретикулоцитов также проводится для мониторинга эффективности химио- и лучевой терапии при опухолях костного мозга.

Кто может назначить анализ и где его можно сделать?

Анализ может назначить терапевт, педиатр, гематолог, инфекционист, хирург или гинеколог. Его делают в государственных поликлиниках и частных медицинских центрах, осуществляющих забор крови для лабораторного исследования. Для подсчета ретикулоцитов берут кровь из пальца или из вены и исследуют ее под микроскопом или с помощью гематологического анализатора. Результат анализа бывает готов на следующий день.

Как подготовиться к исследованию?

На результат анализа могут повлиять некоторые нестероидные противовоспалительные средства, антибиотики группы фторхинолонового и тетрациклинового ряда, производные нитрофурана, транквилизаторы, тиреостатики и другие лекарственные препараты. Поэтому за сутки до исследования желательно прекратить прием лекарств, предварительно согласовав их однодневную отмену с врачом. За 2–3 часа до забора крови желательно не есть и не курить. Можно пить чистую воду без газа.

Какое количество ретикулоцитов считается нормальным?

В абсолютных значениях число ретикулоцитов у женщин должно быть 17–63,8 х 10^9/л, у мужчин оно варьирует от 23 до 70 х 10^9/л. В процентном отношении ретикулоциты составляют от 0,5 до 1,9 % от общего числа эритроцитов. Самое большое количество незрелых эритроцитов отмечается у новорожденных детей (по разным данным от 5 до 15 %). С возрастом их количество постепенно уменьшается. Увеличение числа ретикулоцитов отмечается у беременных, курильщиков и альпинистов.

О каких заболеваниях могут говорить отклонения от нормы?

Повышение количества ретикулоцитов называется ретикулоцитозом, снижение - ретикулоцитопенией. Сам по себе уровень ретикулоцитов не является основанием для постановки какого-либо диагноза, но позволяет врачу более верно предположить, какой патологический процесс происходит в организме.

Уменьшение числа ретикулоцитов или даже полное их отсутствие наблюдается при разных видах анемии (гипопластической, апластической, сидеробластной, вызванной недостатком железа, фолиевой кислоты, витамина B12), при метастазах опухоли в кость, при лечении цитостатиками, лучевой болезни и лучевой терапии.

Причинами ретикулоцитоза могут являться гемолитическая анемия (в этом случае число ретикулоцитов достигает 60 и более процентов), острая кровопотеря (на 3–4 сутки после нее возникает ретикулоцитарный криз), малярия, полицитемия, антианемическое лечение, острый недостаток кислорода. Повышенное количество ретикулоцитов может свидетельствовать о скрытом кровотечении (например, у людей с язвенной болезнью).

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

Предметные стекла.
Шлифованные предметные стекла.
Влажная камера.
Смесители для белых и красных кровяных телец.
Стекла с луночкой.
Микроскоп.
Бриллианткрезиловая синька.
Абсолютный этиловый спирт.
Метиловый спирт или смесь Никифорова (равные части этилового 96° спирта и эфира).
Реактив Гайема или 3% раствор поваренной соли.
Иммерсионное масло.
Набор инструментов для укола в палец.

В зависимости от строения зернисто-сетчатой субстанции различают пять видов ретикулоцитов: пылевидный, венчикообразный, неполносетчатый, полносетчатый и клубкообразный (см. рис).

Взятие крови с целью подсчета в ней ретикулоцитов производят по указанию врача. Чтобы подсчитать количество ретикулоцитов, их окрашивают. С этой целью используют:

Способ прижизненной (суправитальной) окраски ретикулоцитов.
Способ одновременной суправитальной окраски тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву.

Рассмотрим данные способы более подробно.

Прижизненная (суправитальная) окраска ретикулоцитов

Для этого способа необходимы следующие реактивы:

Абсолютный этиловый спирт: в сухую с притертой пробкой посуду помещают прокаленную безводную (белого цвета) сернокислую медь и приливают 1/4 часть абсолютного спирта. Содержимое взбалтывают. Абсолютный спирт (спирт, не содержащий воды) можно получить обезвоживая спирт сернокислой медью, предварительно прокаленной. Обезвоживание прекращают тогда, когда сернокислая медь перестает голубеть.
Насыщенный раствор бриллианткрезиловой синьки в абсолютном спирте: к 80 мл абсолютного спирта прибавляют 1 г бриллианткрезиловой синьки.
Азур I.

Техника прижизненной окраски и подсчета ретикулоцитов

Предметные стекла заранее покрывают насыщенным раствором бриллианткрезиловой синьки. Свежевыступившую каплю крови распределяют по предметному стеклу с краской, как при приготовлении мазка крови. Препарат немедленно помещают на 6-8 минут во влажную камеру, после чего высушивают на воздухе и микроскопируют (окуляр 7Х, объектив 90X с поднятым конденсором). Ретикулоциты подсчитывают точно так же, как , с ограничителем поля зрения. Ретикулоциты, окрашенные бриллианткрезиловой синькой, бледно-зеленые с сеточкой голубого или синего цвета (см. рис.).

Вместо бриллианткрезиловой синьки для окраски ре тикулоцитов можно использовать, согласно прописи Магиной, краску азур I (1 г азура I на 40 мл абсолютного спирта; выдерживают при комнатной температуре 2 дня).

Одновременная суправитальная окраска тромбоцитов и ретикулоцитов по Алексееву

Для этого способа применяют краску Алексеева. В колбу емкостью 100 мл насыпают 1 г краски азур II и добавляют приготовленный в отдельной колбе реактив следующего состава: 5 г лимоннокислого натрия, 4 г хлористого натрия и 45 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы медленно нагревают на асбестовой сетке при постоянном помешивании, не доводя до кипения. Охлаждают, фильтруют. Фильтрат используют в качестве рабочего раствора краски.

Техника одновременной окраски и подсчета тромбоцитов и ретикулоцитов

В смеситель для лейкоцитов до метки 1,0 набирают краску Алексеева, вытирают кончик от краски и кладут на стол. Производят более глубокий, чем обычно, укол в палец. Кровь набирают до 4/5 объема расширенной части смесителя, следя за тем, чтобы в нее не попадали пузырьки воздуха. Кровь быстро выдувают из капиллярной части смесителя на ватку, а остальное содержимое — в луночку предметного стекла. С луночки жидкость вновь набирают в смеситель. Двух-, троекратным повторением этой манипуляции смешивают кровь с реактивом. Набрав последний раз жидкость в смеситель, его оставляют в горизонтальном положении на 15-30 минут для окрашивания ретикулоцитов и тромбоцитов. Затем смеситель встряхивают в течение минуты и выпускают 1-2 капли. Из последующих капель готовят тонкие мазки. Препараты высушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом и докрашивают краской Романовского в разведении 1-2 капли на 1 мл воды в течение 35-45 минут. Краску смывают водой, а мазки высушивают и микроскопируют. В мазке, окрашенном по Алексееву, ретикулоциты розовые с сеточкой синего цвета (см. рис.), а тромбоциты голубовато-сиреневого цвета.

Подсчет ретикулоцитов и тромбоцитов производят одновременно на 1000 эритроцитов так же, как описано в теме «Тромбоциты». Результаты для ретикулоцитов выражают в promille; тромбоциты рассчитывают на 1 мм3 крови (для расчета учитывают количество эритроцитов, подсчитанных у данного больного).

В крови здоровых лиц насчитывают 5-10 % ретикулоцитов.